辽宁绒山羊细管冷冻精液研究
辽宁省辽宁绒山羊原种场 张世伟 宋先忱 朱延旭 刘兴伟
摘 要：本试验比较系统地研究了辽宁绒山羊细管冷冻精液的稀释液及制作工艺。结果表明，离心洗涤去精清可以提高冷冻—解冻后的精子活力，与不去精清的对照组相比差异显著（P<0.05）；以等体积乙二醇替代甘油作防冻剂制作的细管冷冻精液，解冻后的精子活力和顶体完整率显著高于甘油作防冻剂的对照组（P<0.05）。筛选稀释液配方的试验还证明，含Tris的柠檬酸盐缓冲液对提高冷冻后精子活力与顶体完整率具有良好的作用。
关键词：畜牧学；冷冻精液；精清；乙二醇；辽宁绒山羊
山羊精液冷冻保存国外在二十世纪七十年代中期开始研究，我国在其后的八十年代开始了山羊颗粒冻精的制作，进入九十年代，特别是波尔山羊的引进，山羊冻精的研究报导越来越多。据波尔山羊冷冻精液质量监测结果，目前，国内山羊冷冻精液的解冻后活力达30%以上，情期受胎率在60%左右[1]。
辽宁绒山羊原种场在上个世纪八、九十年代研制和应用绒山羊颗粒冻精的基础上，于2000年开始对辽宁绒山羊细管冷冻精液的稀释液、精液处理、冷冻工艺、解冻方法及受胎效果等作了比较系统的研究，取得了较好的成果。
1 试验材料
1.1 精液来源 本研究的绒山羊精液来源于本场核心群的6只公羊，平均射精量1.05ml，精子密度21.86亿/ml，活力在70%以上。根据试验分组需要，采用混精后再等分于各组中。
1.2 试验药品 分析纯无机盐类、糖类及醇类，卵黄、抗菌素等（详见稀释液配方表）
1.3 主要器械 光学显微镜、离心机、超低温温度仪等。
2 试验研究内容与方法
2.1 稀释液配方筛选
2.1.1 稀释液化学药品配方 本试验的基础液化学药品配方如表1所示。
2.1.2 稀释液配制 各配方基础液所用化学药品精确称量，混合加双蒸水搅拌、热溶消毒，配成100ml，冷却后加入青、链霉素各10万单位即构成基础液。Ⅰ液：基础液加20%（V/V）卵黄即为Ⅰ液，用于两次稀释处理的第1次稀释。Ⅱ液：在Ⅰ液中加5%（V/V）甘油即构成Ⅱ液，用于两次稀释处理的第2次稀释。
2.1.3 精液的稀释、降温平衡、灌装与冷冻 采出的新鲜精液在34℃水浴控制下用Ⅰ液作1:2等温稀释，经1.5~2h缓慢降温至4℃用Ⅱ液等温对倍稀释，平衡0.5~1.5h，在4℃将平衡后的精液分装入0.25ml细管，在-95℃±5℃温区内冷冻3min后投入液氮。
2.1.4 细管冻精的解冻与质量评定 冻后的细管精液在40℃水浴解冻，按常规方法检查解冻精子活力、精子存活时间，用姬姆萨染色法测定精子顶体完整率。
配方代号 葡萄糖 乳糖 果糖 蔗糖 柠檬酸 柠檬酸钠 Tris EDTA
A 2.6 3.8 1.3 0.2 0.2
B 3.0 5.5 0.02 1.5 0.02
C 3.0 5.5 1.4 0.12
D 3.0 3.0 1.5
E 5.8 0.12
F 1.2 14.5 0.12
G 3.0 0.1 8 0.05
H 3.1 4.5 1.4
I 3.1 4.6 1.5
J 12.4 3.1
K 3.0 5.5 1.5
L 3.0 1.3 0.1
M 3.0 3.0
N 3.1 4.6 1.5
GL 3.0 5.5 1.5 0.02 0.02
表1 细管冷冻精液稀释液基础液化学药品配方表 单位：g
2.1.5 应用乙二醇作防冻剂与一次稀释的效果 试验分为四组：A组为甘油作防冻剂，两次稀释；B组为甘油作防冻剂一次稀释；C组乙二醇作防冻剂一次性稀释；D组乙二醇作防冻剂两次稀释。一次稀释在精液采出后34
℃等温稀释，两次稀释Ⅱ液均在4 ℃下加入，稀释液采用筛选出的最佳配方。比较各组间解冻后的精液品质。
2.2 细管冷冻精液制作工艺
2.2.1 离心洗涤去精清精液的冷冻效果 取新鲜混合精液1ml加入等温的2.9%柠檬酸钠液4ml，在30℃环境下以1000r/min离心10min后去除上清液，对照组不去除精清，其余处理方法同前述，比较两组精液冷冻-解冻后的精液品质。
2.2.2 降温平衡对精液质量的影响 降温速率与精液冷冻的效果：采得的精液用含乙二醇的稀释液作等温一次稀释。记录34℃降至4℃的时间，其余处理同前，分析降温速率对精液冷冻效果的影响。
平衡时间与冻精质量：本试验测定稀释精液在4℃条件下平衡10min 、0.5h、1h、1.5h、2h、4h的冷冻效果。
2.2.3 冷冻速率与冻精质量 灌装后4℃的0.25ml细管平放于铜纱锣上，用液氮蒸汽熏蒸法冷冻。将超低温温度仪的触头固定在铜纱上，每次冷冻30支。初冻温度设定为-80℃、-90℃、-100℃、-120℃，分批冷冻以细管精液冻透至呈黄白色为准，分析初冻温度即冷冻速率对细管冻精质量的影响。
2.3 解冻升温速率对细管冻精质量的影响
准确记录水浴解冻温度在40℃、50℃、60℃、70℃、80℃时细管冻精解冻（至溶化）所需要的时间。分析解冻时升温的速率与细管冻精质量的关系。
2.4 细管冻精的受胎试验
2001年开展配种受胎试验以检测细管冷冻精液的质量。0.25ml细管冻精标准：解冻后精子活力50％以上，有效精子数5×107个；输精部位于子宫颈口内1~1.5ml处。每次发情输精两次，间隔10~12h。
2.5 试验结果采用SPSS软件进行统计分析
3 结果与分析
3.1 稀释液配方筛选
从15个配方中经过8次试验筛选出5个较好的配方为GL、B、C、K、A，又经过10次试验，各配方精液冷冻的效果如表2所示。
表2 不同稀释液配方细管冻精解冻后的精液质量
配方代号 原精活力(%) 解冻后活力(%) 顶体完整率(%)
A 71.24±3.15 42.24±4.23 42.2±3.21
B 71.24±3.15 51.71±2.82 54.2±3.13
C 71.24±3.15 51.43±3.24 53.4±2.82
K 71.24±3.15 48.42±3.25 47.6±1.24
GL 71.24±3.15 52.42±3.26 55.7±4.30
从表2可以看出GL方效果最好。解冻后精子活力与顶体完整率GL方与 B、C方差异不显著（P＞0.05）、与K方差异显著（P＜0.05＝、与A方相比差异极显著（P＜0.01）。冷冻精液效果较好的GL、B、C三配方均含有Tris，说明含Tris的柠檬酸盐缓冲液在山羊精液冷冻中具有良好的作用。
3.2 应用甘油或乙二醇作防冻剂，两次性稀释与一次稀释的效果
表3 甘油或乙二醇作防冻剂两次或一次稀释的冻精质量
组别 n 解冻后精子活力（%） 顶体完整率（%） 存活时间（h）
A 10 52.15±1.76 54.12±2.83 9.7
B 10 35.28±2.34 30.15±2.42 4.8
C 10 54.34±2.72 55.21±3.24 11.8
D 10 55.12±2.81 56.36±2.63 12.6
注：存活时间为37℃总存活时间减最后两次检测间隔时间的一半。
对表3数据进行统计分析。结果表明，解冻后精子活力与顶体完整率以D组最高， D、C、A与B之间差异极显著（P<0.01）；A与C之间差异显著（P<0.05），C、D之间差异不显著（P>0.05）。存活时间以D组最长，B组最短，A、C组居中。
含甘油的稀释液，两次稀释的A组与一次稀释的B组比较，解冻后活力和顶体完整率差异极显著（P<0.01），说明用甘油作防冻剂必须在低温时作二次稀释时才能添加，一次稀释将使精液冷冻归于失败。乙二醇作防冻剂，即使在较高温度作一次稀释的C组冷冻效果也优于以甘油作防冻剂两次稀释的A组（P<0.05）,
与作两次稀释的D组相比无明显差异。此结果表明，用乙二醇作防冻剂采用一次稀释，可以用于山羊的冻精生产。
根据上述分析结果，相同配方中以乙二醇作防冻剂，冻精解冻后活率、顶体完整率、存活时间多项指标均优于以甘油作防冻剂的稀释液。这与金水仙等的报道相一致[2]。刘玉峰等在绵羊冻精研究中也证实了这一点[3]。一般认为，乙二醇分子比甘油小，渗入或渗出细胞的速率比甘油快，使精子受渗透压的冲击小。乙二醇对细胞的毒性也较小，可在较高温度下添加，可使冻精制作过程中的两次稀释变为一次稀释。所以乙二醇是作为精液和胚胎冷冻较为理想的防冻剂之一。
3.3 离心洗涤去精清精液的冷冻效果
用乙二醇作防冻剂，采用一次稀释装管，经10次重复试验，离心去精清的试验组解冻后精子平均活力（%）58.12±1.31显著高于对照组的54.28±2.13（P<0.05）；两组解冻后精子的顶体完整率（%）和存活时间（h）分别为59.43±1.38，57.56±2.21和1.1、10.5；试验组与对照组间无明显差异。
本试验证明去精清可以使解冻后精子活率提高，这与李拥军等的试验结果相似[4]。国外研究很早就发现山羊精清中含有来自尿道球腺的卵黄凝结酶[5]，可催化卵黄中卵磷脂水解为溶血磷脂类，引起卵黄凝结，造成精子死亡。因此，国外许多学者主张在山羊的精液冷冻中不用含有卵黄的稀释液或在使用含卵黄的稀释液之前去除精清[6]。
3.4 降温速率与平衡时间长短对冻精质量的影响
3.4.1 不同降温速率的冻精质量 稀释后精液从34℃降至4℃的降温速率和精液的冷冻效果见表4。
表4 降温速率对冻精质量的影响
组别
n
降温时间
（min） 降温速率
（℃/min） 冻前活力
（%） 解冻后活力
（%） 顶体完整率（%） 存活时间
（h）
Ⅰ 10 40 0.75 70.25±2.15 57.36±3.24 59.2±2.52 12.0
Ⅱ 10 60 0.50 70.41±3.21 58.21±2.34 58.2±2.16 11.8
Ⅲ 10 80 0.38 70.12±2.34 55.34±3.52 55.3±3.30 10.7
Ⅳ 10 100 0.30 69.41±3.42 55.26±2.81 59.8±2.26 10.3
Ⅴ 10 120 0.25 68.23±2.82 52.34±3.26 57.6±2.41 9.8
Ⅵ 10 180 0.16 65.41±4.33 45.24±3.82 55.0±2.30 9.6
从表4可以看出，精液从34℃降至4℃，降温时间在40~100min的Ⅰ至Ⅳ组，即平均降温速率在0.75℃/min~0.30℃/min之间，对精液的冻前活力、解冻后活力、顶体完整率与存活时间无明显影响。但随降温速率变慢的Ⅴ、
Ⅵ组这些指标均有所降低，其中Ⅵ组的冻后活力显著低于其他各组（P<0.05）。分析原因可能与随降温时间的延长，精子消耗能量增加有关，所以，在精液处理过程中，特别在10℃以上静置的时间不宜过长。试验结果还表明，降温时间从40min延长到180min，精子解冻后的存活时间却从12.0h缩短到9.6h，相差2.4h，说明适当缩短降温时间，可以延长解冻后精子的寿命，有利于提高受胎率。
3.4.2 平衡时间对冻精质量的影响
一般平衡时间包括降温的时间和在4℃静置的时间。本次试验测定稀释精液在4℃条件下平衡时间对冻精质量的影响见表5
表5 4℃平衡时间对冻精质量的影响
组别 n 平衡时间
（min） 解冻后活力
(%) 顶体完整率
（%） 存活时间
（h）
A 12 10 55.28±3.13 56.28±3.43 11.1
B 12 30 58.31±3.48 58.56±3.28 11.2
C 12 60 58.11±3.82 57.81±4.32 11.2
D 12 90 56.32±2.86 54.42±3.82 11.3
E 12 120 54.28±4.32 53.89±2.18 10.5
F 12 240 53.38±3.26 53.15±3.81 10.8
从表5可以看出，在4℃平衡时间从10min至4h的各组精液经冷冻—解冻后的精子活力，顶体完整率与存活时间各项指标无明显差异。似乎在4℃的平衡无关紧要，这在我们应用以乙二醇作为防冻剂的稀释液作一次性稀释的试验中得到了证明，这一点与许多报道在4
℃平衡2~4h的平衡处理大不相同。
3.5 冷冻与解冻工艺与冻精质量
3.5.1 冷冻速度对冻精质量的影响 冷冻时所用温度越低，冷冻的速度越快。研究结果发现，初冻温度以-80℃、-90℃、-100℃、-120℃对0.25ml细管冻精的解冻后活力、顶体完整率无明显差异。但从初步试验的结果看，在-80℃~-120℃温区内快速冷冻的效果要好些。
3.5.2 解冻时的升温速率对细管冻精质量的影响 在对细管冻精采用不同的解冻温度，以及细管在水中摆动的幅度和频率，均会影响升温速率的变化；即使在解冻时升温速率相同，解冻时间不同，也会影响解冻后的冻精质量。
用40℃、50℃、60℃、70℃、80℃不同的水温解冻细管冻精，并使精液回温至20℃，其升温速率分别为27℃/s、43.2℃/s、48℃/s、52.7℃/s
、54℃/s；经10次试验，解冻后的精子平均活力（％）分别为56.21±2.35、57.12±1.98、57.32±2.86、58.25±2.04、58.31±1.36；随解冻升温速率的提高，精子活力有提高的趋势，但无明显差异。在40℃下解冻，经6s、8s、10s后，细管冻精的温度回升至5℃、20℃、37℃，其解冻后平均活力(%)分别为57.33±2.32、57.21±1.76、56.34±2.14,相互之间没有明显差异；而细管冻精溶化后在40℃水温中分别停留4s和90s后，精液温度都回升至40℃，检查两者的解冻后活力也无明显差异，但后者在37℃下的存活时间却比前者缩短了约2h，在其它水温下解冻，也存在类似的规律。
由此可见，冻精解冻后活率有随着升温速率的增加而稍有提高的趋势，但过快的升温速率在实践中不易把握，因此，多采用38℃~40℃解冻。由于冻精解冻后在较高水温中停留时间的延长，会缩短解冻后精子寿命，因此，在操作中只要细管冻精溶化后呈透明状即可取出，此时细管的温度为5℃~12℃，所以解冻后精液的温度应控制在至少不要高于输精时的环境温度，以避免环境温度对冻精质量产生不利的影响。
3.6 细管冷冻精液的受胎试验
2001年开展细管冻精配种受胎试验结果：配种母羊319只，受胎245只，情期受胎率76.80%。
4 结语
4.1 经近四年试验研究，确立了辽宁绒山羊细管冷冻精液制作的基本程序：采得的新鲜精液用2.9%柠檬酸钠液或林格氏液（Ringer’s Solution）1:5等温稀释，以1000r/min离心洗涤10min，去除上清液用GL稀释液Ⅰ液稀释1～3倍释，经40～90min降温至4℃，应用Ⅱ液对倍等温稀释，平衡0.5~1h，分装入0.25ml细管，在-95℃±5℃温度下冷冻3min后投入液氮贮存。解冻后精子活力稳定在55%～58％之间，顶体完整率58%以上，中试配种情期受胎率达78%以上。
4.2 研究结果表明，在辽宁绒山羊细管冷冻精液的制作中，去除精清有助于冻后精子活力的提高；含Tris的柠檬酸盐缓冲液具有良好的作用；以等体积乙二醇替代甘油作防冻剂可以显著提高解冻后精子活力和顶体完整率。
4.3 辽宁绒山羊0.25ml细管精液冷冻的初始温度在-80℃～-120℃之间对冻精质量无明显影响。
4.4 采用较高温度快速解冻细管冻精，解冻后的精液温度不超过10℃，有利于解冻后精子存活时间的延长和受胎率的提高。